産総研とメルシャン、放線菌からビタミンＤを活性化する酵素の分離・精製に成功
不活性型ビタミンＤを活性化する酵素を分離
－骨粗鬆症治療薬などの医薬品の高効率生産へ－
■ポイント■
・放線菌からビタミンＤを活性化（水酸化）する酵素の分離・精製に成功した。
・活性型ビタミンＤの生産性を飛躍的に高めることができる。
・活性型ビタミンＤ類をもとにした新規医薬品・医薬中間体の生産が期待される。
■概要■
独立行政法人 産業技術総合研究所【理事長 吉川 弘之】（以下「産総研」という）ゲノムファクトリー研究部門【研究部門長 鎌形 洋一】遺伝子発現工学研究グループ 田村 具博 研究グループ長は、メルシャン株式会社【代表取締役社長 岡部 有治】生物資源研究所【所長 城道 修】と共同で、骨粗鬆症の治療薬などにも用いられる活性型ビタミンＤを合成する酵素を放線菌より分離・精製することに成功した。
脂溶性ビタミンであるビタミンＤは、動物体内では不活性型として合成された後、活性化の過程を経てはじめて機能する。活性型ビタミンＤは、骨粗鬆症をはじめカルシウム代謝異常に対する治療薬として使用されているが、主要製造法である化学合成では、製造工程が複雑でかつ収量も低いため非常に高価である。
活性型ビタミンＤの生産に利用されている放線菌を対象に、ビタミンＤを不活性型から活性型に変換する酵素（ビタミンＤ水酸化酵素）を探索し、その分離・精製に成功した。その遺伝子を分離・特定したことによりこの酵素の機能を改変することも可能で、活性型ビタミンＤの生産性を飛躍的に高めることができるほか、ビタミンＤ類をもとにした新規医薬品・医薬中間体の生産も期待される。
本技術の詳細は、第１４回国際放線菌学会（１４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃａｔｅｓ， ８月２６～３０日に英国で開催）で発表される。
＜放線菌によるビタミンＤの活性化と水酸化ビタミンＤ類の薬理効果＞
（※ 関連資料を参照してください。）
■開発の社会的背景■
ビタミンＤは、ヒトをはじめとする高等動物において必須の脂溶性ビタミンとして知られ、食物からの摂取あるいは体内でコレステロールの前駆体から生合成されている。摂取あるいは合成されたビタミンＤは不活性型で、肝臓と腎臓で水酸化反応による活性化の過程を経て活性型ビタミンＤとなりはじめて機能する。活性型ビタミンＤの生理作用は、カルシウムの吸収促進や代謝促進、細胞分化誘導、免疫調節作用など多岐にわたり、活性型ビタミンＤおよびビタミンＤ類の改変体は骨粗鬆症治療薬、ビタミンＤ代謝異常による諸症状の治療薬、副甲状腺機能亢進症治療薬、乾癬治療薬などとして使用されている。骨粗鬆症の患者数は国内で約１０００万人、予備軍を含めると２０００万人いると言われ、また乾癬の患者数は世界で１億２，５００万人と推定されており、うち２５％が中等度から重度の患者と考えられている。このことからも安価で効率のよい活性型ビタミンＤを含むビタミンＤ類の改変体製造技術の開発が期待されている。
現在、主に使用されている化学合成による活性型ビタミンＤの製造は、コレステロールを原料におよそ２０もの製造工程を要し、しかも最終産物である活性型ビタミンＤの生産量は原材料の１％程度と少量であり、複雑な製造工程と少量生産により価格も高価となっている。また、化学合成による製造法は、ビタミンＤへの部位選択的な水酸化反応は容易ではないことから、多様なビタミンＤ類改変体の製造には技術的な問題がある。
一方、化学合成に代わる製造法として微生物による活性型ビタミンＤ製造が実用化されている。この微生物は、放線菌の一種で不活性型ビタミンＤを活性型ビタミンＤへ変換する能力をもつ。この微生物から、活性型ビタミンＤへ変換する能力をもつ酵素を分離・精製できれば、活性型ビタミンＤの生産性を飛躍的に高めることのみならず、この酵素の機能を改変することでビタミンＤ類の水酸化改変体とそれらをもとにした新規医薬品・医薬中間体の生産が期待される。
■研究の経緯■
産総研ゲノムファクトリー研究部門遺伝子発現工学研究グループでは、放線菌による化学物質やタンパク質の生産、あるいは有害物質の分解など環境浄化等へ利用できる細胞を構築する研究開発を行ってきた。一方、メルシャン株式会社は、微生物を利用した医薬品製造を行っており、特に微生物由来の酵素、水酸化反応酵素群シトクロムＰ４５０を活用した医薬品や医薬中間体の生産技術の開発を進めている。そこで産総研は、メルシャン株式会社と共同でビタミンＤ活性化（水酸化）に関わる酵素（シトクロムＰ４５０）の分離とその利用研究に取り組んできた。
■研究の内容■
ビタミンＤを不活性型から活性型へ変換する能力をもち、実際、活性型ビタミンＤ製造に使用されているシュードノカルディア属放線菌（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）より、ビタミンＤを活性化（水酸化）する酵素を分離・精製し、この酵素のアミノ酸配列をコードしている遺伝子ＤＮＡを分離した。
手順としては、シュードノカルディア属放線菌を培養した後、菌体を破砕し細胞内のタンパク質を回収した。回収したタンパク質は多数のタンパク質の混合物であり、目的タンパク質の分離精製は、吸着樹脂を利用してビタミンＤの活性型への変換能力を指標として探索を行った。異なる精製吸着樹脂を用いて複数回のステップを経た後、他の不純物タンパク質をできるだけ含まない最終物、ビタミンＤ活性型への変換能力を持つタンパク質（酵素）を分離した。
＜上図：シュードノカルディア属放線菌（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）（メルシャン所有の放線菌）より、ビタミンＤ水酸化酵素の分離＞
＜下図：遺伝子組み換え大腸菌による酵素生産、及び遺伝子組み換えロドコッカス属放線菌（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）（産総研所有の放線菌）によるビタミンＤの活性型への変換＞
（※ 関連資料を参照してください。）
精製したタンパク質のアミノ酸配列を解析し、配列情報をもとにこのタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡを放線菌ゲノムより分離した。得られた遺伝子情報から、データベースによりビタミンＤを活性化しているタンパク質は、シトクロムＰ４５０群に属する水酸化酵素の一つであることが判明した。この放線菌からの精製酵素、ならびに遺伝子組み換え大腸菌を用いて生産した酵素共に不活性型ビタミンＤを活性型ビタミンＤへ変換する能力のあることが確認された。
＜図：大腸菌より生産した組み換え酵素を用いて活性型ビタミンＤへの変換を液体クロマトグラフィーにより解析した。＞
（※ 関連資料を参照してください。）
さらにこの遺伝子を産総研の開発してきたロドコッカス属放線菌（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）に導入して、菌体内にてビタミンＤ水酸化酵素を生産・蓄積させると、培養液に添加した不活性型ビタミンＤが活性型へと変換された。これにより生きた細胞を利用しても、ビタミンＤの活性化されることが確かめられた。
本研究で分離・取得したビタミンＤ水酸化酵素とその遺伝子は、精製酵素あるいは生細胞のどちらにおいても働くので、広範な医薬開発に向けて試験・検討することが可能となった。
■今後の予定■
今後産総研とメルシャンは共同で、活性型ビタミンＤ３の現行製造プロセスにおいて望まれる活性向上型および副作用除去型酵素の取得を目指す。さらに、ビタミンＤ関連化合物を選択的に水酸化できるその他の酵素取得に向けた情報を収集する。メルシャンではこの研究成果を利用して、活性型ビタミンＤの実生産に使用している放線菌に改良遺伝子を導入して、ビタミンＤ類の改変体生産系の構築とその高度化を行う。
以上
（※ 図は関連資料を参照してください。）