理化学研究所、手足の動きを制御する神経回路の左右混線を防ぐ仕組みを解明
手足の動きを制御する神経回路の左右混線を防ぐ仕組みを解明
－ 突然変異マウスの発見から神経回路形成の基本機構の解明まで －
◇ポイント◇
●ウサギのような歩き方をする突然変異マウスを発見し、その原因遺伝子を同定
●αキメリンが運動を制御する神経回路の左右混線を防ぐ鍵であることを発見
●広範な生命現象で重要な働きをする「エフリン－Ｅｐｈシグナル伝達機構」に新展開
独立行政法人理化学研究所（野依良治理事長）は、左右の前後肢をそろえてウサギのような歩き方をする突然変異マウスを発見しました。さらに、その原因となる遺伝子を特定し、左右の体の動きを制御する神経回路が、脊髄（せきずい）正中線を越えて混線することを防ぐ機構を解明しました。理研脳科学総合研究センター（甘利俊一センター長）行動遺伝学技術開発チームの岩里琢治 副チームリーダーら及び国立大学法人京都大学、独立行政法人産業技術総合研究所との共同研究による成果です。本研究は、文部科学省特定領域研究「統合脳」及び独立行政法人科学技術振興機構 戦略的創造研究推進事業「認識と形成」研究領域の一環として行われました。
私たちは、左右の手で異なる動きをしたり、左右の足を交互に出して歩いたりすることができます。こうした動きは、左半身と右半身の運動を制御する神経回路が、脊髄の左右で分離しているからこそ可能になります。これらの回路が形成される時期の脊髄では、左右の境界面である正中線にエフリン（※１）という膜タンパク質が配置されています。一方、神経軸索の先端には、Ｅｐｈ（※１）というエフリンの受容体が配置されています。そして、正中線に突き当たった軸索先端では、エフリンによって刺激されたＥｐｈが軸索内に反発性のシグナルを誘導することで、軸索の伸長が止まることが知られています。しかしながら、エフリンからＥｐｈへのシグナルが、どのようにして軸索の伸長をとめるのかは明らかにされていません。
研究チームでは、特異な歩き方をする突然変異マウスを発見し、そのマウスの運動を制御する神経回路が、脊髄正中線を交差して左右混線していることを見つけました。さらに、順遺伝学と逆遺伝学（※２）の手法を駆使し、ＲｈｏファミリーＧタンパク質（Ｒｈｏファミリー）（※３）を不活性化する因子の一つである「αキメリン（※４）」の遺伝子の欠損が、マウスの異常の原因であることを突き止めました。また、生化学的解析を行い、αキメリンがエフリン－Ｅｐｈシグナル伝達で鍵となる役割を担うことを明らかにしました。本研究により、運動を制御する神経回路ができるとき、脊髄正中線でエフリンに触れた軸索先端のＥｐｈは、αキメリンを介して、Ｒｈｏファミリーのメンバーの一つで軸索伸長の"アクセル役"であるＲａｃを不活性化し、"アクセルを放す"ことで軸索伸長を止め、左右の回路が混線することを防いでいることがわかりました。
エフリン－Ｅｐｈシグナルは、神経回路形成だけでなく、広範な生命現象で重要な働きをしていますが、いずれの系でもその作用機構はほとんどわかっていません。今回の成果は、エフリン－Ｅｐｈシグナル伝達機構の理解を大きく進展させるものであり、神経科学、発生・再生医学など幅広い分野の発展に貢献することが期待されます。
本研究成果は、米国の科学雑誌『Ｃｅｌｌ』（８月２４日付け）に掲載されます。
１．背 景
神経回路が正常に機能するためには、正しい配線が必要です。成長中の神経細胞の軸索先端は、成長円錐と呼ばれる円錐状の構造を持ちます。それが脳や脊髄の中にあるさまざまな標識に誘導されながら進むべき経路をみつけ、正しい標的までたどり着き、神経回路を形成します（図１）。こうした標識となる物質の中で特に重要なものに「エフリン」という細胞膜結合タンパク質があり、成長円錐の進入を防ぐ"進入禁止"を示す標識の役割を担っています。このエフリンと成長円錐の表面にある受容体「Ｅｐｈ」とが作用することにより、反発性のシグナルが誘導され軸索は伸長を止めます。左右の手足の動きを制御する神経軸索が脊髄の正中線を越えることも、この仕組みによって防がれています（図１）。もし、こうした仕組みが壊れれば、混線した神経回路ができあがり、動物の行動は異常をきたすことになります。
ＲｈｏファミリーＧタンパク質（Ｒｈｏファミリー）は軸索伸長を制御する鍵となるものですが、その一つであるＲｈｏＡは軸索伸長の "ブレーキ役"です。ＲｈｏファミリーはＲｈｏ－ＧＥＦという活性化因子によって正の制御を受けますが（図２）、エフリン－ＥｐｈシグナルがＲｈｏ－ＧＥＦ（※５）の一つであるエフェキシン（※６）を介してＲｈｏＡを特異的に活性化することが報告されています。こうした報告に基づきこれまで広く信じられてきた仮説では、「エフリン－Ｅｐｈシグナルはエフェキシンを介してＲｈｏＡを活性化し軸索伸長を止める」、つまり、車に例えれば、進入禁止の標識で止まるためには"ブレーキを踏めばよい"と考えられていました。
一方、ＲｈｏファミリーのメンバーでもＲａｃは軸索伸長の"アクセル役"です。また、ＲｈｏファミリーはＲｈｏ－ＧＡＰ（※７）という不活性化因子によって負の制御を受けます（図２）。したがって、もし、エフリン－ＥｐｈシグナルがＲｈｏ－ＧＡＰを制御することが可能であれば、それを介してＲａｃを不活性化する、すなわち「"アクセルを放す"ことによって軸索伸長を止められるかもしれない」とも考えられます。しかし、これまでエフリン－ＥｐｈシグナルがＲｈｏ－ＧＡＰという抑制系を介してＲｈｏファミリーを制御する可能性、およびその重要性はまったく想定されていませんでした。
さらに、エフリン－Ｅｐｈシグナルは、軸索誘導だけでなく、幅広い生命現象で重要な働きをしますが、これまでその機構はもっぱら培養細胞を用いた単純かつ人工的な環境で研究されてきました。前出のエフェキシンは培養系では非常に重要な働きをすることが示されています。しかし、そのノックアウトマウスは作製されていますが、特別な異常は示さないことが報告されています。したがって、これまで実際の動物の体の中で、エフリン－Ｅｐｈシグナルがどのように働いているかについてほとんどわかっていませんでした。
２．研究手法と成果
（１）新規突然変異マウスの発見
研究チームは、マウスの兄妹交配を行う過程で、左右の前後肢をそろえてウサギのように飛び跳ねる歩き方をするマウスを発見し、「ｍｉｆｆｙ（ミッフィー：ｍｆｙ）変異マウス」と名付けました（図３）。さらにこれが劣性突然変異であることを見いだし、新規の突然変異マウス系統として確立しました。
（２）ｍｆｙ変異マウスにおける大脳皮質－脊髄回路の異常の発見
野生型マウスでは、左半身の動きは脳の右半球、右半身の動きは左半球が制御しています。左右の大脳皮質運動野から伸びた神経軸索は延髄で交差し、反対側の脊髄内の白質を下行、それぞれ必要な場所で髄質に入り、筋肉の動きを制御する末梢運動神経と直接あるいは間接的にシナプスを作り接続します。このとき、通常は脊髄内で左右が再び交差して混線するようなことはありません。ところが、ｍｆｙ変異マウスの大脳皮質－脊髄路をトレーサーで解析した結果、多くの軸索が脊髄正中線を越えて左右混線していることを発見しました（図４）。
（３）ｍｆｙ変異マウスにおける脊髄内局所回路の異常の発見
歩行運動のようなリズミカルな運動は、中枢パターン発生器（ｃｅｎｔｒａｌ ｐａｔｔｅｒｎ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ， ＣＰＧ）とよばれる脊髄内の局所回路の制御を受けることが知られています。マウスの脊髄を培養しある種の刺激を与えるとＣＰＧの制御によって、野生型では左右の筋肉の動きを支配する神経間で交互の信号を発しますが、ｍｆｙ変異マウスではこれと異なり、左右で同調した信号を発していました（図５）。どちらもマウスの歩行パターンと一致します。さらに、トレーサーを用いてＣＰＧ回路を解析した結果、ｍｆｙ変異マウスでは多くの軸索が脊髄正中線を越えて左右混線していることを発見しました（図６）。
（４）原因遺伝子の同定
連鎖解析（※８）によって原因遺伝子が存在する位置を染色体上にマッピングし、その領域内に存在する３０の候補遺伝子を網羅的に解析しました。その結果、ｍｆｙ変異マウスのゲノムでは、αキメリンというＲａｃ特異的なＲｈｏ－ＧＡＰの仲間の遺伝子が壊れていることがわかりました。
さらに、以下の実験により、αキメリンがｍｆｙ変異の原因遺伝子であることを確認しました。
１）αキメリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製しました。そのマウスを用いて、ｍｆｙ変異マウスと交配することにより、変異マウスにαキメリンが導入され、歩行の改善が見られました。
２）ＥＳ細胞を用いた遺伝子標的法によって、αキメリン遺伝子のノックアウトマウスを作製し、解析したところ、ｍｆｙ変異マウスとまったく同様の歩行異常、回路異常を示しました。
（５）シグナル伝達機構の解明
運動を制御する神経軸索の正中線での交差を防ぐ仕組みには、Ｂ３タイプのエフリン（エフリンＢ３）からＡ４タイプのＥｐｈ（ＥｐｈＡ４）へのシグナルが重要なことが知られています。αキメリンがこのシグナルに関与する可能性を以下の実験で検証しました。
１）脳脊髄組織および培養神経細胞を用いて免疫染色を行いました。その結果、ＥｐｈＡ４とαキメリンは運動を制御する神経軸索に一緒に存在していることがわかりました。
２）免疫沈降（※９）を行い、神経細胞でαキメリンとＥｐｈＡ４が結合していることを見つけました。
３）培養細胞にＥｐｈＡ４とαキメリンの両方を発現させると、エフリン刺激によってＲａｃの不活性化が誘導できました。しかし、ＥｐｈＡ４とαキメリンのどちらか一方が欠ければＲａｃ不活性化は起きませんでした。したがって、エフリンＢ３－ＥｐｈＡ４シグナルがαキメリンを介してＲａｃの不活性化をすることが確認できました。
４）ＥｐｈＡ４を発現する神経細胞を培養しエフリンＢ３で刺激すると、成長円錐崩壊（＝ 軸索退縮）が起きることが知られています。しかし、ｍｆｙ変異マウス由来の神経細胞やノックダウン法でαキメリンのタンパク量を減らした神経細胞では、この反応が起きにくくなります。したがって、エフリンＢ３－ＥｐｈＡ４のシグナルが成長円錐崩壊を誘導する反応を、αキメリンが媒介していることが明らかになりました。
（６）まとめ
研究グループは、マウスと培養細胞系にまたがる包括的な解析を行うことによって、エフリン－Ｅｐｈシグナルが神経回路の混線を防ぐ仕組みを、世界で初めて明らかにしました。成長円錐の表面にあるＥｐｈＡ４が、脊髄正中線においてエフリンＢ３の"進入禁止"の標識を認識すると、成長円錐内でＥｐｈＡ４に結合しているαキメリンが活性化されます。するとαキメリンは、Ｒａｃを不活性化します。Ｒａｃは、成長円錐を前進させる働きをするタンパク質であるため、その働きを抑制すると成長円錐の前進は止まります（図７左）。ところが、ｍｆｙ変異マウスでは、αキメリンがないため成長円錐は止まることができず、正中線を越えて左右の神経が混線し、両足がそろった歩き方といった運動異常を生じます（図７右）。つまり、運動を制御する神経軸索の伸長を脊髄の正中線で止めるためには、"ブレーキを踏む"ことではなく、αキメリンというＲｈｏ－ＧＡＰを介して、Ｒａｃというアクセル役を不活性化すること、つまり、"アクセルを放す"ことが鍵であることを見つけました。
３．今後の期待
運動を制御する神経軸索が正中線を越えて左右混線すると左右の手足の使い分けができなくなりますが、今回の研究結果から、それを防ぐ仕組みが世界で初めて明らかになりました。このことは、脊髄損傷の再生医療研究においても重要な知見となると考えられます。また、ヒトでも、両手が同時に動いてしまうなどのミラー・ムーブメントを示す遺伝病が数家系知られていますが、いずれでも原因遺伝子はわかっていません。本研究成果がその原因究明の手がかりになる可能性があります。
また、エフリン－Ｅｐｈのシグナルは、軸索誘導だけでなく、樹状突起やスパインの形成、記憶学習、体節形成、細胞移動、臓器形成、新脈管形成などさまざまなところで重要な働きをする分子ですが、その仕組みに関してはほとんどわかっていません。主に培養神経細胞を用いた研究からは、さまざまな生命現象においてエフリン－Ｅｐｈのシグナルは、特異的なＲｈｏ－ＧＥＦを活性化し、それにより特異的なＲｈｏファミリーメンバーを活性化することによって機能していると考えられてきました。つまり、これまでは"アクセルを踏む"、"ブレーキを踏む"という操作だけでアクチン細胞骨格を制御し機能していると想像されてきました。
一方、キメリンはＲｈｏ－ＧＡＰと呼ばれる分子群のメンバーであり、この分子群はＲｈｏファミリーを不活性化します。つまり、Ｒｈｏ－ＧＡＰのメンバーは、"アクセルを放す"、"ブレーキを放す"という働きをします。本研究により、エフリン－Ｅｐｈシグナルの作用機構に、Ｒｈｏ－ＧＡＰという大きな分子群が関与することが初めて明らかになりました。このことは、さまざまな系でのエフリン－Ｅｐｈのシグナルの働きの理解、関連した病気の治療法の開発にも貢献することが期待されます。
※補足説明と図１～７は添付資料をご参照下さい。