産総研、自ら光る蛍光タンパク質による高精度細胞イメージング技術を開発
■自ら光る蛍光タンパク質による高精度細胞イメージング技術の開発
－外部照射光なしで、光る蛍光タンパク質－
ポイント
・ 外部照射光なしで、自ら光る蛍光タンパク質（自己励起蛍光タンパク質）を開発
・ 蛍光タンパク質の種類によって発光スペクトルを変えることができる
・ オリジナルのルシフェラーゼよりも４倍明るく、生きている１細胞の活動を観察できる
＜概要＞
独立行政法人 産業技術総合研究所【理事長 吉川 弘之】（以下「産総研」という）セルエンジニアリング研究部門【部門長 三宅 淳】セルダイナミクス研究グループ 星野 英人 研究員は、近江谷 克裕 研究グループ長（現 北海道大学大学院医学研究科 教授）、中島 芳浩 主任研究員とともに、ルシフェリンールシフェラーゼ反応を利用して緑色蛍光タンパク質を効率よく発光させる技術とそれを利用した新しい生物発光イメージング技術を開発した。
これまで緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の応用には蛍光を光らせるために外部光源を必要としていた。一方、ホタルなどの発光生物はルシフェラーゼという酵素の働きでルシフェリンという物質を酸化して、自ら発光する。今回、ＧＦＰとルシフェラーゼを結合させることによってルシフェリンさえあれば、外部光源なしでＧＦＰを光らせる技術を開発した。ＧＦＰの種類を変えることによって発光色を変えることもできる。さらに本技術を応用して１細胞レベルでも観察が可能な新しい生物発光イメージング技術を開発した。
本研究の成果は、平成１９年７月８日（アメリカ東部時間）に、米国の国際科学誌Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ電子版に掲載される。
＊ 関連資料「図１ ルシフェリン添加による試験管内での発光」 参照
＜開発の社会的背景＞
我々の日常生活において、『光技術』は必要不可欠な基盤技術であり、既に様々な発光システムが開発、利用されている。一方、我が国では、生物発光現象は『蛍の光』として古くから親しまれてきたが、最近、その発光メカニズムの解明が進行しつつある。生物発光は簡便な操作で高感度且つ高精度で迅速に計測できるユニークな天然のシステムであり、その基本原理の解明と新たなシステム開発が望まれている。
＜研究の経緯＞
産総研では、生物発光の持つ可能性を探索し、生活に役立つ技術を目指した基礎技術として発展させてきた。セルダイナミクス研究グループでは、これまでに甲虫由来のルシフェラーゼを用いた３色ルシフェラーゼ技術の開発および実用化、並びにウミホタル由来の分泌性ルシフェラーゼ技術の開発および実用化を行っている。
一方、従来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は外部励起光源を必要とし、測定にはこの励起光を除去して蛍光のみを選別する仕組みを必要とし、蛍光顕微鏡など複雑な計測システムでの利用に限られていた。我々は、オワンクラゲ、ウミシイタケといった海洋性発光生物のＧＦＰを有する発光生物が本来備えている、ルシフェリンをエネルギー源としてＧＦＰを光らせる、「生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ、 Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）」という現象に注目した。この現象を応用して簡便にＧＦＰを光らせる技術とそれを用いた生物発光イメージング技術の開発を試みた。
本研究における“生物発光による１細胞イメージング技術の開発”は、独立行政法人 新エネルギー・産業技術総合開発機構（ＮＥＤＯ）細胞内ダイナミズム解析プロジェクトで推進したものである。
＜研究の内容＞
図２に示すように緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と海洋性発光生物ウミシイタケのルシフェラーゼを適当なリンカーペプチドで結合した人工タンパク質を作製し、リンカーペプチド配列の最適化を行った。
その結果、非常に高効率のＢＲＥＴを誘導することに成功した。我々は、これを自己励起蛍光タンパク質－ＢＲＥＴ－ｂａｓｅｄ Ａｕｔｏ－ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ－ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＡＦ）－という概念として提唱している。
＊ 関連資料「図２． 自己励起蛍光タンパク質（ＢＡＦ）の概念図」 参照
３種のＧＦＰ変異体（ＡｃＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ）を用いた人工タンパク質を作製しそれぞれＢＡＦ－Ａ、ＢＡＦ－Ｇ、ＢＡＦ－Ｙと名付けた。これらは、ルシフェリンさえあれば蛍光を発する（図１）。用いるＧＦＰ変異体の特性により発光スペクトルが変化している（図３左）。図３右は、タンパク質量あたりこれら人工タンパク質の発光強度がルシフェラーゼ本来の強度に比べて約４倍に増強されていることを示している。これは共鳴エネルギー移動により、元のルシフェラーゼの発光量が増幅されたと考えられる。
＊ 関連資料「図３．元のルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）と今回開発の自己励起蛍光タンパク質（ＢＡＦ）の発光スペクトル」 参照
培養細胞で発現させたＢＡＦ－Ｙは生きた細胞中でも高い効率で発光した。細胞核のＤＮＡに集積するタンパク質（ヒストンＨ２ＡＸ）にＢＡＦ－Ｙを融合した人工タンパク質を発現させた細胞を、新しく開発した生物発光顕微鏡・ＡＢ３０００Ｂ Ｃｅｌｌｇｒａｐｈ（ＡＴＴＯ）で観察した。図４に示すように高い空間および時間解像度での１細胞生物発光イメージングに世界で初めて成功した。
＊ 関連資料「図４．ＢＡＦ－Ｙを用いた１細胞レベルでの生物発光イメージング」 参照
＜今後の予定＞
我々は、本研究においてＢＡＦがルシフェラーゼと緑色蛍光タンパク質との組合せにより、将来、より明るい生物発光プローブとして更に改善できる可能性を示した。今後、ＢＡＦ自体の更なる改良と高効率ＢＲＥＴが起こる分子機構の解明を目指すとともに、細胞内で起こる現象を高精度且つリアルタイムにモニタ可能な生物発光イメージングシステムを目指す。また、簡便な検査試薬としての可能性も追求したい。
＜用語の説明＞
◆ルシフェラーゼ
発光基質（ルシフェリン、後述）の酸化を触媒することで、発光を引き起こす酵素の総称。ホタルルシフェラーゼが最も有名であるが、その他に、イクオリン（オワンクラゲ）、ウミシイタケルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼなどがある。
◆ルシフェリン
ルシフェラーゼの発光基質の総称。ルシフェラーゼの存在下、ルシフェリンが酸化されてオキシルシフェリンと二酸化炭素になるときに発光する。ホタルルシフェリンが最もよく知られているが、他にセレンテラジン（ウミシイタケルシフェリンとも言う）とウミホタルルシフェリンなどがある。尚、ＢＡＦ技術で用いられるルシフェリンはセレンテラジンである。
◆緑色蛍光タンパク質
１９６２年に下村脩博士によりオワンクラゲから精製された分子量２６ｋＤのタンパク質。Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎを略してＧＦＰとも呼ぶ。適当な波長の励起光を当てることにより緑色蛍光を発する。
◆生物発光と蛍光
一般的に、生物発光とは発光基質（ルシフェリン）の酸化反応を発光酵素（ルシフェラーゼ）が触媒する酵素反応を言う。ルシフェリンが酸化されて出来るオキシルシフェリンの高いエネルギー状態（励起状態という）から低いエネルギー状態（基底状態）に遷移する過程で放出されるエネルギーの一部が光となる。一方、蛍光とは、蛍光物質に適当な波長の光を当てることにより、励起状態（蛍光物質＊）を誘発し、基底状態に戻る際に放出されるエネルギーの一部が光となる現象である。生物発光と蛍光の大きな違いは、前者がルシフェリンの酸化反応をエネルギー源とするのに対して、蛍光では励起光をエネルギー源とする点にある。
◆生物発光共鳴エネルギー移動
Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、略してＢＲＥＴと呼ぶ。天然にＧＦＰを有する生物（オワンクラゲ、ウミシイタケなど）がＧＦＰを光らせるために獲得した機構でもある。ルシフェラーゼとＧＦＰが適切な配向性を保ちながら、１－１０ ｎｍに近接することで起こる。その際、ルシフェラーゼの発光スペクトルとＧＦＰの励起スペクトルの間に十分な重なりが必要となる。簡単に言えば、ルシフェリンールシフェラーゼ反応で蛍光タンパク質を光らせる現象である。
＜問い合わせ＞
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